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जेवियर फिडाल्गो, * पियरे-एंटोनी डेगल्सने, * रोड्रिगो अरोयो, * लिलियन सेपुलेवेदा, * एवगेनिया रानेवा, फिलिप डेप्रेज़ विज्ञान विभाग, स्किन टेक फार्मा ग्रुप, कैस्टेलो डी'एम्परीज़, कैटेलोनिया, स्पेन * इन लेखकों के पास इस काम में कुछ अंतर्दृष्टि है। योगदान पृष्ठभूमि: Hyaluronic एसिड (HA) एक प्राकृतिक रूप से पाया जाने वाला पॉलीसेकेराइड है जिसका उपयोग सौंदर्य प्रयोजनों के लिए त्वचीय भराव के उत्पादन में किया जाता है।चूंकि मानव ऊतकों में इसका आधा जीवन कई दिनों का होता है, इसलिए HA-आधारित त्वचीय भराव को शरीर में उनके जीवन का विस्तार करने के लिए रासायनिक रूप से संशोधित किया जाता है।वाणिज्यिक एचए-आधारित फिलर्स में सबसे आम संशोधन एचए श्रृंखलाओं को क्रॉसलिंक करने के लिए क्रॉसलिंकिंग एजेंट के रूप में 1,4-ब्यूटेनडिओल डिग्लिसिडिल ईथर (बीडीडीई) का उपयोग है।अवशिष्ट या अप्राप्य BDDE को <2 भाग प्रति मिलियन (पीपीएम) पर गैर-विषाक्त माना जाता है;इसलिए, रोगी की सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए अंतिम त्वचीय भराव में अवशिष्ट BDDE की मात्रा निर्धारित की जानी चाहिए।सामग्री और विधियां: यह अध्ययन तरल क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) के संयोजन से क्षारीय परिस्थितियों में बीडीडीई और एचए के बीच क्रॉस-लिंकिंग प्रतिक्रिया के उप-उत्पाद का पता लगाने और लक्षण वर्णन का वर्णन करता है।परिणाम: विभिन्न विश्लेषणों के बाद, यह पाया गया कि HA-BDDE हाइड्रोजेल कीटाणुरहित करने के लिए उपयोग की जाने वाली क्षारीय स्थितियों और उच्च तापमान ने इस नए उप-उत्पाद, "प्रोपलीन ग्लाइकोल-जैसे" यौगिक के गठन को बढ़ावा दिया।एलसी-एमएस विश्लेषण ने पुष्टि की कि उप-उत्पाद में बीडीडीई के समान मोनोआइसोटोपिक द्रव्यमान है, एक अलग प्रतिधारण समय (टीआर), और एक अलग यूवी अवशोषक (λ = 200 एनएम) मोड है।बीडीडीई के विपरीत, एलसी-एमएस विश्लेषण में यह देखा गया कि समान माप स्थितियों के तहत, इस उप-उत्पाद की 200 एनएम पर उच्च पहचान दर है।निष्कर्ष: इन परिणामों से संकेत मिलता है कि इस नए यौगिक की संरचना में कोई एपॉक्साइड नहीं है।व्यावसायिक उद्देश्यों के लिए HA-BDDE हाइड्रोजेल (HA त्वचीय भराव) के उत्पादन में पाए जाने वाले इस नए उप-उत्पाद के जोखिम का आकलन करने के लिए चर्चा खुली है।कीवर्ड: हयालूरोनिक एसिड, हा त्वचीय भराव, क्रॉस-लिंक्ड हयालूरोनिक एसिड, BDDE, LC-MS विश्लेषण, BDDE उप-उत्पाद।
हयालूरोनिक एसिड (एचए) पर आधारित फिलर्स कॉस्मेटिक उद्देश्यों के लिए उपयोग किए जाने वाले सबसे आम और लोकप्रिय त्वचीय भराव हैं।1 यह त्वचीय भराव एक हाइड्रोजेल है, जो आमतौर पर> 95% पानी और 0.5-3% HA से बना होता है, जो उन्हें जेल जैसी संरचना देता है।2 HA एक पॉलीसेकेराइड है और कशेरुकियों के बाह्य मैट्रिक्स का मुख्य घटक है।अवयवों में से एक।इसमें (1,4) -ग्लुकुरोनिक एसिड-β (1,3)-N-एसिटाइलग्लुकोसामाइन (GlcNAc) ग्लाइकोसिडिक बॉन्ड्स से जुड़ी हुई डिसैकराइड इकाइयों को दोहराते हैं।यह डिसैकराइड पैटर्न सभी जीवों में समान होता है।कुछ प्रोटीन-आधारित फिलर्स (जैसे कोलेजन) की तुलना में, यह गुण HA को अत्यधिक जैव-संगत अणु बनाता है।ये फिलर्स अमीनो एसिड अनुक्रम विशिष्टता प्रदर्शित कर सकते हैं जिसे रोगी की प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा पहचाना जा सकता है।
जब एक त्वचीय भराव के रूप में उपयोग किया जाता है, तो HA की मुख्य सीमा हयालूरोनिडेस नामक एंजाइमों के एक विशिष्ट परिवार की उपस्थिति के कारण ऊतकों के भीतर इसका तेजी से कारोबार होता है।अब तक, हा संरचना में कई रासायनिक संशोधनों को ऊतकों में हा के आधे जीवन को बढ़ाने के लिए वर्णित किया गया है।3 इनमें से अधिकांश संशोधन HA श्रृंखलाओं को क्रॉस-लिंक करके पॉलीसेकेराइड पॉलिमर तक hyaluronidase की पहुंच को कम करने का प्रयास करते हैं।इसलिए, HA संरचना और क्रॉस-लिंकिंग एजेंट के बीच पुलों और इंटरमॉलिक्युलर सहसंयोजक बंधों के निर्माण के कारण, क्रॉस-लिंक्ड HA हाइड्रोजेल प्राकृतिक HA की तुलना में अधिक एंटी-एंजाइम गिरावट उत्पादों का उत्पादन करता है।4-6
अब तक, क्रॉसलिंक किए गए HA का उत्पादन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले रासायनिक क्रॉसलिंकिंग एजेंटों में मेथैक्रिलामाइड, 7 हाइड्राज़ाइड, 8 कार्बोडाइमाइड, 9 डिवाइनिल सल्फ़ोन, 1,4-ब्यूटेनडिओल डिग्लाइसीडिल ईथर (BDDE) और पॉली (एथिलीन ग्लाइकॉल) डिग्लिसिडिल ईथर शामिल हैं।10,11 बीडीडीई वर्तमान में सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला क्रॉसलिंकिंग एजेंट है।हालांकि इस प्रकार के हाइड्रोजेल दशकों से सुरक्षित साबित हुए हैं, उपयोग किए जाने वाले क्रॉसलिंकिंग एजेंट प्रतिक्रियाशील अभिकर्मक हैं जो साइटोटोक्सिक हो सकते हैं और कुछ मामलों में, उत्परिवर्तजन।12 इसलिए, अंतिम हाइड्रोजेल में उनकी अवशिष्ट सामग्री अधिक होनी चाहिए।BDDE को तब सुरक्षित माना जाता है जब अवशिष्ट सांद्रता 2 भाग प्रति मिलियन (पीपीएम) से कम हो।4
एचए हाइड्रोजेल में कम-अवशेष बीडीडीई एकाग्रता, क्रॉस-लिंकिंग डिग्री और प्रतिस्थापन स्थिति का पता लगाने के लिए कई तरीके हैं, जैसे गैस क्रोमैटोग्राफी, आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस), परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) फ्लोरोसेंस माप विधियों के साथ मिलकर, और डायोड सरणी युग्मित उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी)।13-17 यह अध्ययन क्षारीय परिस्थितियों में BDDE और HA की प्रतिक्रिया द्वारा उत्पादित अंतिम क्रॉस-लिंक्ड HA हाइड्रोजेल में उप-उत्पाद की पहचान और लक्षण वर्णन का वर्णन करता है।एचपीएलसी और तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस विश्लेषण)।चूंकि BDDE के इस उप-उत्पाद की विषाक्तता अज्ञात है, इसलिए हम अनुशंसा करते हैं कि इसके अवशेषों की मात्रा का निर्धारण अंतिम उत्पाद में आमतौर पर BDDE पर की जाने वाली विधि के समान तरीके से किया जाना चाहिए।
HA (Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan) के प्राप्त सोडियम नमक का आणविक भार ~ 1,368,000 Da (लॉरेंट विधि) 18 और आंतरिक चिपचिपापन 2.20 m3/kg है।क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया के लिए, BDDE (%95%) को सिग्मा-एल्ड्रिच कंपनी (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से खरीदा गया था।पीएच 7.4 के साथ फॉस्फेट बफर खारा सिग्मा-एल्ड्रिच कंपनी से खरीदा गया था।एलसी-एमएस विश्लेषण में प्रयुक्त सभी सॉल्वैंट्स, एसीटोनिट्राइल और पानी एचपीएलसी ग्रेड गुणवत्ता से खरीदे गए थे।फॉर्मिक एसिड (98%) को अभिकर्मक ग्रेड के रूप में खरीदा जाता है।
सभी प्रयोग यूपीएलसी एक्विटी सिस्टम (वाटर्स, मिलफोर्ड, एमए, यूएसए) पर किए गए थे और एक इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण स्रोत (एबी एससीआईईएक्स, फ्रामिंघम, एमए, यूएसए) से लैस एपीआई 3000 ट्रिपल क्वाड्रुपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर से जुड़े थे।
क्रॉस-लिंक्ड HA हाइड्रोजेल का संश्लेषण 1% क्षार (सोडियम हाइड्रॉक्साइड, NaOH) की उपस्थिति में 10% (w/w) सोडियम हाइलूरोनेट (NaHA) घोल में 198 मिलीग्राम BDDE जोड़कर शुरू किया गया था।प्रतिक्रिया मिश्रण में अंतिम बीडीडीई एकाग्रता 9.9 मिलीग्राम/एमएल (0.049 मिमी) थी।फिर, प्रतिक्रिया मिश्रण को अच्छी तरह से मिलाया गया और समरूप बनाया गया और 4 घंटे के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ने दिया गया।19 अभिक्रिया का pH ~12 पर बना रहता है।
इसके बाद, प्रतिक्रिया मिश्रण को पानी से धोया गया, और अंतिम HA-BDDE हाइड्रोजेल को फ़िल्टर किया गया और पीबीएस बफर के साथ 10 से 25 मिलीग्राम / एमएल की एचए एकाग्रता और 7.4 के अंतिम पीएच को प्राप्त करने के लिए पतला किया गया।उत्पादित क्रॉस-लिंक्ड एचए हाइड्रोजेल को निष्फल करने के लिए, इन सभी हाइड्रोजेल को ऑटोक्लेव किया जाता है (20 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस)।शुद्ध BDDE-HA हाइड्रोजेल को विश्लेषण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाता है।
क्रॉस-लिंक्ड एचए उत्पाद में मौजूद बीडीडीई का विश्लेषण करने के लिए, 240 मिलीग्राम के नमूने को तौला गया और केंद्र छेद (माइक्रोकॉन®; मर्क मिलिपोर, बिलरिका, एमए, यूएसए; वॉल्यूम 0.5 एमएल) में पेश किया गया और कमरे के तापमान पर 10,000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। 10 मिनट।पुल-डाउन तरल के कुल 20 μL एकत्र किए गए और उनका विश्लेषण किया गया।
क्षारीय स्थितियों (1%, 0.1% और 0.01% NaOH) के तहत BDDE मानक (सिग्मा-एल्ड्रिच सह) का विश्लेषण करने के लिए, यदि निम्नलिखित शर्तें पूरी होती हैं, तो तरल नमूना 1:10, 1:100, या अधिकतम है। 1:1,000,000 यदि आवश्यक हो, तो विश्लेषण के लिए MilliQ विआयनीकृत पानी का उपयोग करें।
क्रॉस-लिंकिंग रिएक्शन (HA 2%, H2O, 1% NaOH, और 0.049 mM BDDE) में उपयोग की जाने वाली शुरुआती सामग्रियों के लिए, इन सामग्रियों से तैयार किए गए प्रत्येक नमूने के 1 एमएल का विश्लेषण समान विश्लेषण स्थितियों का उपयोग करके किया गया था।
आयन मानचित्र में दिखाई देने वाली चोटियों की विशिष्टता निर्धारित करने के लिए, 100 पीपीबी बीडीडीई मानक समाधान (सिग्मा-एल्ड्रिच सह) के 10 µ एल को 20 µ एल नमूने में जोड़ा गया था।इस मामले में, प्रत्येक नमूने में मानक की अंतिम एकाग्रता 37 पीपीबी है।
सबसे पहले, 990 μL MilliQ पानी (घनत्व 1.1 g/एमएल) के साथ मानक BDDE (सिग्मा-एल्ड्रिच सह) के 10 μL को पतला करके 11,000 मिलीग्राम/एल (11,000 पीपीएम) की एकाग्रता के साथ एक BDDE स्टॉक समाधान तैयार करें।एक मध्यवर्ती मानक कमजोर पड़ने के रूप में 110 µ g/L (110 पीपीबी) BDDE समाधान तैयार करने के लिए इस समाधान का उपयोग करें ।फिर, 75, 50, 25, 10, और 1 पीपीबी की वांछित एकाग्रता प्राप्त करने के लिए मध्यवर्ती मंदक को कई बार पतला करके मानक वक्र तैयार करने के लिए मध्यवर्ती BDDE मानक मंदक (110 पीपीबी) का उपयोग करें।जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, यह पाया गया है कि 1.1 से 110 पीपीबी तक के बीडीडीई मानक वक्र में अच्छी रैखिकता (R2>0.99) है।मानक वक्र को चार स्वतंत्र प्रयोगों में दोहराया गया था।
चित्रा 1 एलसी-एमएस विश्लेषण द्वारा प्राप्त बीडीडीई मानक अंशांकन वक्र, जिसमें एक अच्छा सहसंबंध मनाया जाता है (आर 2> 0.99)।
संकेताक्षर: BDDE, 1,4-ब्यूटेनडिओल डिग्लिसिडिल ईथर;एलसी-एमएस, तरल क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री।
आधार समाधान में क्रॉस-लिंक्ड HA और BDDE मानकों में मौजूद BDDE मानकों की पहचान और मात्रा निर्धारित करने के लिए, LC-MS विश्लेषण का उपयोग किया गया था।
क्रोमैटोग्राफिक पृथक्करण एक LUNA 2.5 माइक्रोन C18 (2) -HST कॉलम (50 × 2.0 मिमी 2; फेनोमेनेक्स, टॉरेंस, सीए, यूएसए) पर प्राप्त किया गया था और विश्लेषण के दौरान कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर रखा गया था।मोबाइल चरण में एसीटोनिट्राइल (विलायक ए) और पानी (विलायक बी) होता है जिसमें 0.1% फॉर्मिक एसिड होता है।मोबाइल चरण को ग्रेडिएंट रेफरेंस द्वारा सुसंस्कृत किया जाता है।ग्रेडिएंट इस प्रकार है: 0 मिनट, 2% A;1 मिनट, 2% ए;6 मिनट, 98% ए;7 मिनट, 98% ए;7.1 मिनट, 2% ए;10 मिनट, 2% ए। चलने का समय 10 मिनट है और इंजेक्शन की मात्रा 20 μL है।BDDE का अवधारण समय लगभग 3.48 मिनट (प्रयोगों के आधार पर 3.43 से 4.14 मिनट तक) है।एलसी-एमएस विश्लेषण के लिए मोबाइल चरण को 0.25 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर पंप किया गया था।
एमएस द्वारा बीडीडीई विश्लेषण और मात्रा का ठहराव के लिए, यूपीएलसी सिस्टम (वाटर्स) को एक एपीआई 3000 ट्रिपल क्वाड्रुपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर (एबी एससीआईईएक्स) के साथ जोड़ा जाता है जो इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण स्रोत से लैस होता है, और विश्लेषण सकारात्मक आयन मोड (ईएसआई +) में किया जाता है।
BDDE पर किए गए आयन फ्रैगमेंट विश्लेषण के अनुसार, उच्चतम तीव्रता वाले टुकड़े को 129.1 Da (चित्र 6) के अनुरूप टुकड़ा होना निर्धारित किया गया था।इसलिए, परिमाणीकरण के लिए बहु-आयन निगरानी मोड (MIM) में, BDDE का द्रव्यमान रूपांतरण (मास-टू-चार्ज अनुपात [m/z]) 203.3/129.1 Da है।यह एलसी-एमएस विश्लेषण के लिए पूर्ण स्कैन (एफएस) मोड और उत्पाद आयन स्कैन (पीआईएस) मोड का भी उपयोग करता है।
विधि की विशिष्टता को सत्यापित करने के लिए, एक रिक्त नमूने (प्रारंभिक मोबाइल चरण) का विश्लेषण किया गया था।203.3/129.1 Da के बड़े पैमाने पर रूपांतरण के साथ रिक्त नमूने में कोई संकेत नहीं मिला।प्रयोग की पुनरावृत्ति के संबंध में, 55 पीपीबी (अंशांकन वक्र के बीच में) के 10 मानक इंजेक्शनों का विश्लेषण किया गया, जिसके परिणामस्वरूप अवशिष्ट मानक विचलन (आरएसडी) <5% (डेटा नहीं दिखाया गया)।
अवशिष्ट BDDE सामग्री को चार स्वतंत्र प्रयोगों के अनुरूप आठ अलग-अलग ऑटोक्लेव्ड BDDE क्रॉस-लिंक्ड HA हाइड्रोजेल में निर्धारित किया गया था।जैसा कि "सामग्री और विधियों" खंड में वर्णित है, परिमाणीकरण का मूल्यांकन BDDE मानक कमजोर पड़ने के प्रतिगमन वक्र के औसत मूल्य द्वारा किया जाता है, जो कि 203.3/129.1 Da के BDDE बड़े पैमाने पर संक्रमण में पाए गए अद्वितीय शिखर से मेल खाती है, एक प्रतिधारण के साथ 3.43 से 4.14 मिनट का समय प्रतीक्षा नहीं।चित्रा 2 10 पीपीबी बीडीडीई संदर्भ मानक का एक उदाहरण क्रोमैटोग्राम दिखाता है।तालिका 1 आठ अलग-अलग हाइड्रोजेल की अवशिष्ट BDDE सामग्री को सारांशित करती है।मूल्य सीमा 1 से 2.46 पीपीबी है।इसलिए, नमूने में अवशिष्ट बीडीडीई सांद्रता मानव उपयोग के लिए स्वीकार्य है (<2 पीपीएम)।
चित्र 2 10 पीपीबी बीडीडीई संदर्भ मानक (सिग्मा-एल्ड्रिच सह), एमएस (एम/जेड) के आयन क्रोमैटोग्राम 203.30/129.10 दा (सकारात्मक एमआरएम मोड में) के एलसी-एमएस विश्लेषण द्वारा प्राप्त संक्रमण।
संकेताक्षर: BDDE, 1,4-ब्यूटेनडिओल डिग्लिसिडिल ईथर;एलसी-एमएस, तरल क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री;एमआरएम, एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी;एमएस, मास;एम/जेड, मास-टू-चार्ज अनुपात।
नोट: नमूने 1-8 ऑटोक्लेव्ड बीडीडीई क्रॉस-लिंक्ड हा हाइड्रोजेल हैं।हाइड्रोजेल में BDDE की अवशिष्ट मात्रा और BDDE अवधारण समय के शिखर की भी सूचना दी गई है।अंत में, अलग-अलग अवधारण समय के साथ नई चोटियों के अस्तित्व की भी सूचना दी गई है।
संकेताक्षर: BDDE, 1,4-ब्यूटेनडिओल डिग्लिसिडिल ईथर;हा, हयालूरोनिक एसिड;एमआरएम, एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी;टीआर, अवधारण समय;एलसी-एमएस, तरल क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री;आरआरटी, सापेक्ष अवधारण समय।
आश्चर्यजनक रूप से, एलसी-एमएस आयन क्रोमैटोग्राम के विश्लेषण से पता चला है कि विश्लेषण किए गए सभी ऑटोक्लेव्ड क्रॉस-लिंक्ड एचए हाइड्रोजेल नमूनों के आधार पर, 2.73 से 3.29 मिनट के छोटे प्रतिधारण समय पर एक अतिरिक्त शिखर था।उदाहरण के लिए, चित्रा 3 एक क्रॉस-लिंक्ड एचए नमूने के आयन क्रोमैटोग्राम को दिखाता है, जहां एक अतिरिक्त शिखर लगभग 2.71 मिनट के एक अलग अवधारण समय पर प्रकट होता है।नए देखे गए शिखर और BDDE से शिखर के बीच प्रेक्षित सापेक्ष अवधारण समय (RRT) 0.79 (तालिका 1) पाया गया।चूंकि हम जानते हैं कि एलसी-एमएस विश्लेषण में इस्तेमाल किए गए सी18 कॉलम में नई देखी गई चोटी को कम रखा गया है, नई चोटी बीडीडीई की तुलना में अधिक ध्रुवीय यौगिक के अनुरूप हो सकती है।
चित्रा 3 एलसी-एमएस (एमआरएम जन रूपांतरण 203.3/129.0 दा) द्वारा प्राप्त क्रॉस-लिंक्ड हा हाइड्रोजेल नमूने का आयन क्रोमैटोग्राम।
संकेताक्षर: हा, हयालूरोनिक एसिड;एलसी-एमएस, तरल क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री;एमआरएम, एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी;आरआरटी, सापेक्ष अवधारण समय;टीआर, प्रतिधारण समय।
इस संभावना से इंकार करने के लिए कि देखे गए नए शिखर मूल रूप से उपयोग किए गए कच्चे माल में मौजूद दूषित हो सकते हैं, इन कच्चे माल का भी उसी एलसी-एमएस विश्लेषण पद्धति का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था।विश्लेषण की गई प्रारंभिक सामग्रियों में पानी, पानी में 2% NaHA, पानी में 1% NaOH और क्रॉस-लिंकिंग प्रतिक्रिया में उपयोग की जाने वाली समान सांद्रता में BDDE शामिल हैं।उपयोग की गई प्रारंभिक सामग्री के आयन क्रोमैटोग्राम ने कोई यौगिक या शिखर नहीं दिखाया, और इसका अवधारण समय देखे गए नए शिखर से मेल खाता है।यह तथ्य इस विचार को खारिज करता है कि न केवल प्रारंभिक सामग्री में कोई यौगिक या पदार्थ हो सकते हैं जो विश्लेषण प्रक्रिया में हस्तक्षेप कर सकते हैं, लेकिन अन्य प्रयोगशाला उत्पादों के साथ संभावित क्रॉस-संदूषण का कोई संकेत नहीं है।बीडीडीई और नई चोटियों के एलसी-एमएस विश्लेषण के बाद प्राप्त एकाग्रता मूल्यों को तालिका 2 (नमूने 1-4) और चित्रा 4 में आयन क्रोमैटोग्राम में दिखाया गया है।
नोट: नमूने 1-4 ऑटोक्लेव्ड बीडीडीई क्रॉस-लिंक्ड हा हाइड्रोजेल का उत्पादन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले कच्चे माल के अनुरूप हैं।ये नमूने ऑटोक्लेव नहीं थे।
संकेताक्षर: BDDE, 1,4-ब्यूटेनडिओल डिग्लिसिडिल ईथर;हा, हयालूरोनिक एसिड;एलसी-एमएस, तरल क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री;एमआरएम, एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी।
चित्रा 4 हा और बीडीडीई की क्रॉस-लिंकिंग प्रतिक्रिया में प्रयुक्त कच्चे माल के नमूने के एलसी-एमएस क्रोमैटोग्राम से मेल खाती है।
नोट: इन सभी को समान सांद्रता और अनुपात में मापा जाता है जिसका उपयोग क्रॉस-लिंकिंग प्रतिक्रिया को अंजाम देने के लिए किया जाता है।क्रोमैटोग्राम द्वारा विश्लेषण किए गए कच्चे माल की संख्या के अनुरूप हैं: (1) पानी, (2) 2% एचए जलीय घोल, (3) 1% NaOH जलीय घोल।एलसी-एमएस विश्लेषण 203.30/129.10 दा (सकारात्मक एमआरएम मोड में) के बड़े पैमाने पर रूपांतरण के लिए किया जाता है।
संकेताक्षर: BDDE, 1,4-ब्यूटेनडिओल डिग्लिसिडिल ईथर;हा, हयालूरोनिक एसिड;एलसी-एमएस, तरल क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री;एमआरएम, एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी।
जिन परिस्थितियों के कारण नई चोटियों का निर्माण हुआ, उनका अध्ययन किया गया।क्रॉस-लिंक्ड HA हाइड्रोजेल का उत्पादन करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रतिक्रिया की स्थिति BDDE क्रॉस-लिंकिंग एजेंट की प्रतिक्रियाशीलता को कैसे प्रभावित करती है, इसका अध्ययन करने के लिए, नई चोटियों (संभावित उप-उत्पादों) के गठन के लिए, विभिन्न माप किए गए थे।इन निर्धारणों में, हमने अंतिम बीडीडीई क्रॉसलिंकर का अध्ययन और विश्लेषण किया, जिसे जलीय माध्यम में NaOH (0%, 1%, 0.1%, और 0.01%) के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया था, इसके बाद या बिना ऑटोक्लेविंग के।समान परिस्थितियों का अनुकरण करने के लिए जीवाणु प्रक्रिया वही है जो क्रॉस-लिंक्ड HA हाइड्रोजेल का उत्पादन करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधि है।जैसा कि "सामग्री और विधियों" खंड में वर्णित है, नमूने के बड़े पैमाने पर संक्रमण का विश्लेषण एलसी-एमएस द्वारा 203.30/129.10 दा के लिए किया गया था।बीडीडीई और नए शिखर की एकाग्रता की गणना की जाती है, और परिणाम तालिका 3 में दिखाए जाते हैं। नमूनों में कोई नई चोटियों का पता नहीं चला था, जो समाधान में NaOH की उपस्थिति की परवाह किए बिना ऑटोक्लेव नहीं थे (नमूने 1-4, तालिका 3))।ऑटोक्लेव्ड नमूनों के लिए, समाधान में NaOH की उपस्थिति में ही नई चोटियों का पता लगाया जाता है, और शिखर का निर्माण समाधान में NaOH एकाग्रता पर निर्भर करता है (नमूने 5-8, तालिका 3) (RRT = 0.79)।चित्रा 5 एक आयन क्रोमैटोग्राम का एक उदाहरण दिखाता है, जो NAOH की उपस्थिति या अनुपस्थिति में दो ऑटोक्लेव्ड नमूने दिखा रहा है।
संकेताक्षर: BDDE, 1,4-ब्यूटेनडिओल डिग्लिसिडिल ईथर;एलसी-एमएस, तरल क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री;एमआरएम, एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी।
नोट: शीर्ष क्रोमैटोग्राम: नमूना को 0.1% NaOH जलीय घोल और ऑटोक्लेव्ड (20 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस) के साथ इलाज किया गया था।निचला क्रोमैटोग्राम: नमूना का इलाज NaOH के साथ नहीं किया गया था, लेकिन उन्हीं परिस्थितियों में ऑटोक्लेव किया गया था।203.30/129.10 डीए (सकारात्मक एमआरएम मोड में) के बड़े पैमाने पर रूपांतरण का विश्लेषण एलसी-एमएस द्वारा किया गया था।
संकेताक्षर: BDDE, 1,4-ब्यूटेनडिओल डिग्लिसिडिल ईथर;एलसी-एमएस, तरल क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री;एमआरएम, एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी।
सभी ऑटोक्लेव किए गए नमूनों में, NaOH के साथ या उसके बिना, BDDE एकाग्रता बहुत कम हो गई थी (16.6 गुना तक) (नमूने 5-8, तालिका 2)।BDDE सांद्रता में कमी इस तथ्य के कारण हो सकती है कि उच्च तापमान पर, पानी 1,2-डायोल यौगिक बनाने के लिए BDDE के एपॉक्साइड वलय को खोलने के लिए एक आधार (न्यूक्लियोफाइल) के रूप में कार्य कर सकता है।इस यौगिक का मोनोआइसोटोपिक गुण BDDE से भिन्न है और इसलिए यह प्रभावित नहीं होगा।एलसी-एमएस ने 203.30/129.10 दा के बड़े पैमाने पर बदलाव का पता लगाया।
अंत में, इन प्रयोगों से पता चलता है कि नई चोटियों की पीढ़ी BDDE, NAOH और ऑटोक्लेविंग प्रक्रिया की उपस्थिति पर निर्भर करती है, लेकिन इसका HA से कोई लेना-देना नहीं है।
लगभग 2.71 मिनट के अवधारण समय पर पाया गया नया शिखर तब एलसी-एमएस द्वारा विशेषता था।इस प्रयोजन के लिए, BDDE (9.9 mg/mL) को 1% NaOH जलीय घोल में इनक्यूबेट किया गया और ऑटोक्लेव किया गया।तालिका 4 में, नए शिखर की विशेषताओं की तुलना ज्ञात BDDE संदर्भ शिखर (अवधारण समय लगभग 3.47 मिनट) से की जाती है।दो चोटियों के आयन विखंडन विश्लेषण के आधार पर, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि 2.72 मिनट के अवधारण समय के साथ शिखर BDDE शिखर के समान टुकड़े दिखाता है, लेकिन विभिन्न तीव्रताओं के साथ (चित्र 6)।2.72 मिनट के अवधारण समय (पीआईएस) के अनुरूप शिखर के लिए, 147 दा के द्रव्यमान पर विखंडन के बाद एक अधिक तीव्र शिखर देखा गया।इस निर्धारण में प्रयुक्त बीडीडीई एकाग्रता (9.9 मिलीग्राम/एमएल) पर, पराबैंगनी स्पेक्ट्रम में विभिन्न अवशोषण मोड (यूवी, = 200 एनएम) भी क्रोमैटोग्राफिक पृथक्करण (चित्रा 7) के बाद देखे गए थे।2.71 मिनट के अवधारण समय के साथ शिखर अभी भी 200 एनएम पर दिखाई दे रहा है, जबकि बीडीडीई शिखर समान परिस्थितियों में क्रोमैटोग्राम में नहीं देखा जा सकता है।
तालिका 4 लगभग 2.71 मिनट के प्रतिधारण समय के साथ नए शिखर के लक्षण वर्णन परिणाम और 3.47 मिनट के अवधारण समय के साथ बीडीडीई शिखर
नोट: इन परिणामों को प्राप्त करने के लिए, एलसी-एमएस और एचपीएलसी विश्लेषण (एमआरएम और पीआईएस) दो चोटियों पर किए गए थे।एचपीएलसी विश्लेषण के लिए, 200 एनएम की तरंग दैर्ध्य के साथ यूवी का पता लगाने का उपयोग किया जाता है।
संकेताक्षर: BDDE, 1,4-ब्यूटेनडिओल डिग्लिसिडिल ईथर;एचपीएलसी, उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी;एलसी-एमएस, तरल क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री;एमआरएम, एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी;एम/जेड, मास-टू-चार्ज अनुपात;पीआईएस, उत्पाद आयन स्कैनिंग;पराबैंगनी प्रकाश, पराबैंगनी प्रकाश।
नोट: बड़े पैमाने पर टुकड़े एलसी-एमएस विश्लेषण (पीआईएस) द्वारा प्राप्त किए जाते हैं।शीर्ष क्रोमैटोग्राम: BDDE मानक नमूना अंशों का द्रव्यमान स्पेक्ट्रम।निचला क्रोमैटोग्राम: नए शिखर का पता लगाया गया द्रव्यमान स्पेक्ट्रम (BDDE शिखर से जुड़ा RRT 0.79 है)।BDDE को 1% NaOH समाधान में संसाधित किया गया और ऑटोक्लेव किया गया।
संकेताक्षर: BDDE, 1,4-ब्यूटेनडिओल डिग्लिसिडिल ईथर;एलसी-एमएस, तरल क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री;एमआरएम, एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी;पीआईएस, उत्पाद आयन स्कैन;आरआरटी, सापेक्ष अवधारण समय।
चित्र 7 203.30 दा अग्रदूत आयन का आयन क्रोमैटोग्राम, और (ए) 2.71 मिनट के प्रतिधारण समय के साथ नया शिखर और (बी) 200 एनएम पर 3.46 मिनट पर बीडीडीई संदर्भ मानक शिखर का यूवी पता लगाना।
उत्पादित सभी क्रॉस-लिंक्ड एचए हाइड्रोजेल में, यह देखा गया कि एलसी-एमएस परिमाणीकरण के बाद अवशिष्ट बीडीडीई एकाग्रता <2 पीपीएम थी, लेकिन विश्लेषण में एक नया अज्ञात शिखर दिखाई दिया।यह नया शिखर BDDE मानक उत्पाद से मेल नहीं खाता।BDDE मानक उत्पाद भी सकारात्मक MRM मोड में समान गुणवत्ता रूपांतरण (MRM रूपांतरण 203.30/129.10 Da) विश्लेषण से गुजरा है।आम तौर पर, क्रोमैटोग्राफी जैसे अन्य विश्लेषणात्मक तरीकों का उपयोग हाइड्रोजेल में बीडीडीई का पता लगाने के लिए सीमा परीक्षण के रूप में किया जाता है, लेकिन अधिकतम पता लगाने की सीमा (एलओडी) 2 पीपीएम से थोड़ी कम है।दूसरी ओर, अब तक, एनएमआर और एमएस का उपयोग क्रॉस-लिंक्ड एचए उत्पादों की चीनी इकाई के टुकड़ों में क्रॉस-लिंकिंग और/या एचए के संशोधन की डिग्री को चिह्नित करने के लिए किया गया है।इन तकनीकों का उद्देश्य इस तरह के कम सांद्रता में अवशिष्ट बीडीडीई का पता लगाने के लिए कभी नहीं रहा है जैसा कि हम इस लेख में वर्णन करते हैं (हमारी एलसी-एमएस विधि का एलओडी = 10 पीपीबी)।
पोस्ट करने का समय: सितंबर-01-2021